特发性视神经炎相关动物模型的研究进展

本文原载于《中华眼科杂志》年第4期

特发性视神经炎（opticneuritis，ON）是发生在视神经的特发性炎性反应病变，为中青年人最易罹患的致盲性眼病。ON并不是一种单一的疾病，而是由不同病因引起的发生在视神经这一共同部位的多种病变的集合体。根据病因可将特发性ON分为经典多发性硬化（multiplesclerosis，MS）相关性视神经炎（MSrelatedopticneuritis，MS-ON）、视神经脊髓炎（neuromyelitisoptica，NMO）相关性视神经炎（NMOrelatedopticneuritis，NMO-ON）以及其他中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）脱髓鞘疾病相关性视神经炎[1]。目前对ON动物模型的研究也从单一的MS-ON模型，向建立不同病因导致的ON模型发展。本文主要针对临床最常见的两种ON动物模型的研究，即MS-ON及NMO-ON动物模型进行分析和总结，并对模型相关的检测指标进行简要概述。

一、MS-ON动物模型

在西方国家，由于ON与多发性硬化密切相关，故ON最常见的模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE）模型。这种模型是模拟人MS的经典模型，主要表现为免疫诱导的脱髓鞘过程。EAE模型中的ON总是与脑和脊髓的炎性反应及脱髓鞘改变相伴，但ON的诱导成功率及炎性反应严重程度不一。

（一）EAE模型

EAE模型是目前研究MS及MS-ON的理想模型。可以通过抗原的主动免疫或特异性T淋巴细胞的被动转移，诱导出以CNS反复发生的炎性脱髓鞘为特点的迟发性变态反应性疾病。

1．主动免疫EAE模型：

应用CNS髓鞘抗原主动免疫动物，诱导体内产生针对髓鞘抗原的免疫反应，从而在CNS产生炎性反应性脱髓鞘反应。随着所采用的髓鞘抗原成分逐渐纯化，ON的诱导效率越来越高。最初采用的是视神经组织、脊髓或脑组织匀浆，可诱导出视神经不同程度的炎性反应、脱髓鞘改变、轴索损伤，但是其ON的发病率不稳定。进一步采用纯化的髓鞘成分，如髓鞘蛋白脂蛋白、髓鞘碱性蛋白（myelinbasicprotein，MBP）或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelinoligodendrocyteglycoprotein，MOG），ON的诱导率大大提高。例如应用髓鞘蛋白脂蛋白诱导小鼠EAE，ON的发病率达到71.4%[2]；应用MBP诱导Lewis大鼠致EAE模型，ON的发病率更高[3]。目前MOG35-55相关肽诱导C57BL/6J小鼠慢性EAE模型[4,5,6]，ON的发病率可高达80%以上，而且若在MOG抗原免疫诱导的同时加入二甲基亚砜，可成功将ON的诱导率提高到80%~90%[7]。这可能与视神经组织MOG抗原表达丰富相关。研究发现MOG35-55免疫抗原剂量的差异对模型病程亦有影响，高剂量的MOG诱导出慢性非缓解型EAE模型，而低剂量的MOG抗原诱导出复发-缓解型EAE[8]。

2．被动免疫EAE模型：

在被髓鞘蛋白抗原免疫动物的脾或淋巴结中，将被活化的T淋巴细胞分离并转移至健康动物体内。这种模型主要用于研究特定炎症细胞或炎性反应因子在免疫发病机制中的作用。例如髓鞘特异性T细胞诱导C57BL/6小鼠致EAE伴严重的ON，ON的发病率达到63.6%[9]。年Larabee等[10]用MOG35-55特异性Th17细胞诱导的EAE模型，诱导出以单眼为主的视力丢失、ON性反应、视网膜神经节细胞（retinalganglioncell，RGC）变性等MS-ON的病理改变。

EAE模型的优点在于与MS的自体免疫病理学特征和分散发病特点基本一致，促进了MS免疫治疗方面药物研究的发展。但不足之处：（1）EAE与MS在免疫调节和病理方面仍然存在一些差异[11]。例如MS的病灶中主导的T细胞亚群不是CD4+，而是CD8+；对改善EAE有效的方法，如干扰素γ治疗或TNF拮抗疗法，治疗MS无效甚至有害；EAE模型仅提供了MS进程中的部分阶段，髓鞘的再生在EAE模型中未能体现等。（2）由于同时合并脑组织病变，脑组织功能异常可能影响视觉诱发电位等视功能的检测结果，故无法精确反映视神经病变导致的视功能改变。

（二）其他MS模型

除了上述常见的MS模型外，还有转基因和病毒、毒素诱导的MS-ON模型。例如年Anderson等[12]在非肥胖型糖尿病小鼠背景基础上建立了MOG35-55特异性T细胞抗原受体转基因小鼠模型，此模型自发性同时产生CD4+和CD8+T细胞，发现单独的CD8+T细胞可诱导ON和轻度的EAE，而CD4+T细胞单独作用即可诱导严重的EAE，认为髓鞘反应性CD4+T细胞才是疾病的主要驱动因素，二者共同存在主要是推动疾病发展。同时，还有以病毒（如Theiler鼠型脑炎病毒）或毒素（如环己酮草酰二腙、溶血卵磷脂、溴化乙锭等）诱导的脱髓鞘模型，以往均被认为是MS模型。然而，随着对MS发病机制认识的深入，由于MS为T细胞介导的自身免疫反应，脱髓鞘是病变的结果，故目前认为脱髓鞘模型不等同于MS模型；而且，至今尚无一种神经系统性病毒被确认在MS发病中发挥作用，故现已极少使用病毒和毒素诱导模型。

二、NMO-ON动物模型

NMO是目前唯一病因明确的ON。在NMO的特异性致病抗体NMO-IgG[13]被发现以前，并没有NMO特异性动物模型，也没有NMO-ON特异性动物模型。目前已经明确NMO-IgG是80%NMO患者的病因，因此有关NMO及NMO-ON的动物模型分为两类：（1）NMO-IgG相关：代表NMO-IgG血清阳性NMO；（2）非NMO-IgG相关：如MOG相关NMO模型，模拟NMO-IgG血清阴性NMO。然而，有关NMO-ON发病机制的认识大多源于针对动物模型脑和脊髓的研究，而关于ON本身病理改变和发病机制的研究较少。

（一）NMO-IgG相关NMO-ON模型

迄今为止，以水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）为抗原免疫的动物，尚未能诱导出NMO样病灶，原因可能与AQP4的致病性和AQP4蛋白在体内细胞膜内的立体构象有关。因此，线性AQP4抗原蛋白免疫动物不能产生具有致病性的AQP4抗体[14]，只有具有致病性的AQP4抗体才能诱导NMO-IgG相关的NMO模型。

1．视神经局部注射NMO-IgG的NMO-ON模型：

近年来出现了与脊髓局部注射相关的NMO模型，如在CD59基因敲除鼠腰5-6椎间隙单次鞘内注射NMO-IgG和人补体，建立NMO脊髓炎模型[15]。Lewis大鼠反复鞘膜内注射人NMO-IgG，亦可建立缓解复发NMO病变的过程[16]。受此类模型启发，目前出现了视神经局部注射模型。例如Matsumoto等[17]将NMO-IgG阳性血清直接注射到SD（Sprague-Dawley）大鼠的视神经鞘内，建立了NMO-ON模型，可观察到星形胶质细胞（astrocyte，AS）变性、炎症细胞浸润以及RGC丢失。Asavapanumas等[18]在小鼠视交叉附近连续3d泵入NMO-IgG和人补体，产生了类似NMO病理学特点的ON，表现为AQP4、胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）、MBP和神经丝局灶性丢失，炎症细胞浸润，小胶质细胞活化，血脑屏障破坏，NMO-IgG沉积以及补体活化，RGC丢失；CD95敲除鼠视神经病理改变明显加重，提示在ON模型中补体的重要作用。该类NMO模型出的特异性视神经病变由于仅局限于视神经，排除脑部病灶的干扰，能建立视神经病理改变与视功能检测结果之间的对应关系，有利于研究视神经病变对视功能的影响，适用于研究NMO-ON的发病机制以及评价治疗药物对病变视神经解剖和功能的影响。

2．EAE联合腹腔注射NMO-IgG的NMO模型：

虽然NMO-IgG是NMO的致病性抗体，但由于NMO-IgG无法通过完整的血脑屏障进入CNS[19]，故直接向大鼠腹腔注射AQP4-IgG不能建立NMO动物模型。除了机械性损伤破坏血脑屏障，还可以通过EAE模型诱导动物血脑屏障破坏，然后在EAE高峰期，腹腔注射NMO-IgG[19]或NMO-IgG阳性患者血清，亦是制造动物模型的一种方法。此模型明显增加了EAE的损伤程度，而且病灶主要累及AQP4高表达的位置，病理改变也与NMO早期的病理改变极相似。近期有研究使用高浓度的纯化人NMO-IgG或高亲和性的抗AQP4单克隆抗体（EA），在EAE小鼠模型的脑、脊髓和视神经中诱导出了典型的严重NMO病灶[20]。此模型也是最早证明NMO-IgG致病性的被动转移实验方法[19,21]。同时Zeka等[22]筛选出强致病性AQP–肽特异性T细胞，结合NMO患者的提纯NMO-IgG，注射诱导Lewis大鼠致实验性自身免疫性视神经脊髓炎，在CNS多处出现炎症细胞浸润改变伴AS破坏，但是视神经除炎症细胞浸润外，其AS无损伤，考虑该现象与鼠类的遗传背景有关，认为EAE中视神经损伤常见于BN（BrownNorway）大鼠和DA（DarkAgouti）大鼠[23]。

此类模型是研究NMO早期病灶形成机制的理想模型，但其主要缺点是可能存在EAE本身病理变化的干扰，无法完全代表NMO-IgG在损伤形成中的作用；而且需要大量的NMO-IgG，ON诱导率较低；脑组织病变影响视功能检查结果，故无法完全反映视神经局部病变对视功能的影响。

（二）MOG-IgG相关NMO模型

临床上除5%~40%NMO患者的血清为NMO-IgG阴性外[24,25,26]，其余患者的致病性抗体不明，以致以NMO-IgG致病性为基础的动物模型不适于这部分患者NMO发病机制的研究。研究结果显示在NMO-IgG阴性的患者中，约21.1%为MOG-IgG阳性，故出现了MOG相关的NMO动物模型[24]。虽然人抗MOG抗体与啮齿类MOG抗原基本不结合[25]，但是将来自MOG-IgG阳性NMO患者血清中的抗MOG抗体注射入小鼠脑组织中，能诱发出脱髓鞘反应和轴突蛋白的改变，但这些变化是可逆的，而且没有补体介导的髓鞘丢失和神经元、AS死亡等NMO病灶中的严重反应[27]。此外有研究发现，高滴度人源MOG抗体会增强EAE大鼠的脱髓鞘反应[28]。但是，MOG动物模型多采用鼠源性MOG抗原和抗体，如以鼠源MOG肽片段主动免疫或被动转移MOG特异T细胞进入野生型B6小鼠，可诱导ON[9]。这些动物模型中所用的不是人源MOG-IgG结合的表位，因此不能完全代表人MOG-IgG的致病性。

此外，关于MOG相关EAE模型诱导的CNS炎性反应属于MS还是NMO，尚存在争议。从上述研究结果可以看出，MOG是EAE模型中重要的自身抗原和自身抗体的靶点。这种CNS特有的髓鞘蛋白，只位于少突胶质细胞表面，含量极微，存在于髓鞘最外层，具有很强的免疫源性，是免疫细胞和抗体首先攻击的靶抗原。然而，有些MOG诱导的动物模型表现出NMO的疾病改变及分布特征，又被认为应该属于NMO模型。例如用重组大鼠MOG免疫LEW.1AV1大鼠[29]，60%大鼠出现ON，%大鼠出现脊髓炎，而大脑未出现病灶。Collongues等[30]使用大鼠重组MOG和不完全弗氏佐剂免疫诱导制备视神经脊髓脱髓鞘模型，80%以上大鼠视神经和脊髓出现脱髓鞘改变和炎症细胞浸润，视神经AS的AQP4表达减少而AS标志物GFAP增加，脊髓AQP4和GFAP表达均增加。Bettelli等[31]首次通过MOG特异性T细胞转基因鼠与MOG特异性B细胞抗体转基因鼠杂交，形成双转基因C57BL/6小鼠模型，即2D2转基因小鼠模型。这种转基因小鼠体内大于98%的T细胞表达MOG35-55特异性T细胞抗原受体，自发性孤立性ON诱导率30%，而且无脑和脊髓受累的表现，成为研究ON视功能和免疫病理改变的最常用模型。Bell等[32]的2D2转基因小鼠模型能自发出现ON及脊髓炎表现，并不累及大脑和小脑，亦被认为是NMO模型，其免疫病理改变主要是Th1细胞浸润，但无补体沉积或粒细胞浸润等病理改变，发病机制考虑为炎性反应因子的作用。2D2转基因小鼠模型进一步提示NMO-IgG阴性的NMO，MOG可能是靶抗原。Herges等[33]通过MOG特异性Th17细胞诱导EAE小鼠模型，此模型出现视神经和脊髓的中性粒细胞浸润，涵盖了NMO的多个方面。因此，MOG相关EAE模型模拟的CNS病理改变性质还有待进一步验证。

三、ON动物模型评价指标

目前对ON动物模型制造是否成功以及病变严重程度的评估，主要依靠免疫病理学分析。其不足之处是不能直接评估活体动物的视功能和视神经形态及其动态变化。随着可用于小型动物的高分辨率MRI、频域相干光层析成像术（spectral-domainopticalcoherencetomography，SD-OCT）、闪光视觉诱发电位（flashvisualevokedpotential，F-VEP）等检测手段的出现，现在对ON动物模型的检测更加完善。

（一）形态学指标

最常见的形态学指标莫过于免疫病理学指标，通常包括RGC计数、炎症细胞浸润情况检测、免疫病理学检测（MBP、AQP4、GFAP等）、视神经髓鞘评估、AS及轴突病理改变观察、视神经损伤程度生物标记物检测等。例如EAE小鼠模型视神经在mRNA及蛋白水平，其IL-6受体、IL-23受体、AQP4显著升高；血清学检测AQP4、IL-6、IL-17A、IL-23均升高而TGF-β下降[34]。2D2转基因小鼠模型血清中磷酸化神经丝重链较阴性对照组升高3倍，并被证实其来源于视神经轴突损伤，可作为视神经损伤的标志物[35]。

过去由于啮齿类动物体型较小，视神经部位则更为纤细，传统的3.0T场强的MRI分辨率不够。直到高场强MRI的出现，如4.7T[35,36]或7T[32]，甚至9.4T的MRI，极大地提高了检查的分辨率，使小鼠的视神经均可清晰显示。联合使用二乙三胺五醋酸钆增强剂能显示血脑屏障渗漏，反映病灶的活动性。例如2D2转基因小鼠模型MRI检查示病灶仅在视神经和脊髓，脑室虽然有增强，但大脑实质内无病灶；随着时间推移，病灶处增强剂渗漏逐渐加重；视神经处的MRI改变在脑室改变之前出现[32]。能效CT、能比质谱MRI等最新技术，可更精确分析病灶中的化学成分。为观察动物视盘、视神经纤维的动态变化，有研究者将SD-OCT应用于转基因鼠[35]，以清晰显示小鼠视盘及视神经纤维情况，但是尚无法准确测量RGC层；OCT结合图形视网膜电图（patternelectroretinogram，P-ERG）研究结果显示，视盘凹陷小鼠的P-ERG振幅较低。

（二）功能学指标

以往，常对脊髓功能进行评分（5分），以脊髓控制的四肢和尾部功能的神经运动情况，评价动物脊髓病变的严重程度，而对视功能的评价不足。目前已有多种视功能评价方法，如黑白箱行为学检测[37,38]，即利用啮齿类动物喜欢黑暗环境的习性，通过记录比较大鼠或小鼠在相邻的黑箱（暗环境）和白箱（明亮环境）停留的时间比例，评估视力改变情况，这种方法对视力的判断虽然粗糙，但是结果可靠。瞳孔反应，即使用瞳孔计[39]或数码摄像机[40,41]，比较不同时间点瞳孔反应情况，从而评估视功能。例如光照刺激30s后瞳孔收缩的比例[40]，虽然不能对视力进行定量分析，但却是最客观的视功能检测指标。电生理检测不仅能精确显示视功能变化，而且无创，能对整个发病过程的视功能变化进行跟踪观察。评估动物视功能变化的常用方法：（1）F-VEP：潜伏期和振幅的改变，可客观反映视神经轴突和髓鞘的损伤情况[40,42]。（2）P-ERG[35,36]及闪光视网膜电图的明视负波反应波[37,38]：可有效检测RGC功能，观察波形振幅和潜伏期的改变，同时与形态学或其他功能学改变比较一致性。（3）视动实验（optokineticheadtrackingthresholdmeasurement，OKT）[4,43]：观察引起小鼠头部规律运动的黑白条纹最低空间频率阈值，以反映视力水平。EAE小鼠模型以OKT作为ON发作的指标，发现OKT频率的下降比VEP潜伏期延长出现得更早，两者均在EAE评分最低时达到最差值，EAE评分恢复时恢复，但是不能恢复至正常水平[4]。由此可知，OKT是比VEP更为灵敏的功能损伤检测指标。

四、展望

建立符合或接近不同类型ON临床特征的理想动物模型是研究ON病因、病理改变及发病机制的重要基础。虽然目前在MS-ON和NMO-ON动物模型方面已取得长足进步，但是因受制于发病机制不明，这些模型只能部分模拟人的ON改变。虽然MS的EAE和NMO动物模型均能诱导一定比例的ON，但在不同的模型中ON的诱导率有很大差异。这说明ON的发病机制可能与脑和脊髓的病变有所不同。因此，需要能更特异、更高效模拟ON的动物模型，以不断加深对ON发病机制和病理改变的理解。此外，目前评价动物模型的指标多为免疫病理学改变，对动物行为学及视功能的客观评价还比较欠缺。

参考文献